AFFYMETRIX基因芯片操作流程
第一章真核靶片断制备
＜一＞RNA的抽提
一、哺乳动物细胞或组织RNA的抽提
1.总RNA使用QIAGEN'哺乳动物组织作为
+ 动物细胞使用 哺乳 动物组织作为 离步骤 | RNeasy Total RNA Isolation kit 成功抽提哺乳动物细胞总 | RNA. |
RNA 的来源，建议使用 TRIzol 抽提总RNA. QIAGEN ' Oligotex Direct mRNA kit,从总 RNA 中抽提 mRNA . RNA 的来源，应首先 使用 TRIzol 纯化，再进行一个 Poly(A)+mRNA 分 | ||
或使用kit.
二、RNA沉淀
1.总RNA
在用RNeasy Total RNA Isolation kit 分离或洗涤后没有必要沉淀总积以制备cDNA 合成接近希望的 RNA 浓度。
RNA.调整洗脱体
注：为获得足够量的标记 cRNA 用来评估和基因芯片表达探针杂交， AFFYMETRIX 建议开 始合成cDNA 的
Poly(A) +mRNA 最小浓度为0.02 卩g/卩l 时的最小量是0.2 卩g,总RNA 最 小浓度为0.5 卩g/卩l 时的最小
量是5 卩g.这样有两个好处：
(2)制备足够的cRNA 用于杂交 (1)有足够量在各步检查样品浓度和质量
2. Poly(A) mRNA + 在TRIzol 分离和热酚提取后需要乙醇沉淀；见下面方法
大多数Poly(A) +mRNA 分离过程都会导致得到较稀浓的 RNA，所以需要在cDNA 合成前
浓缩mRNA.
3. 沉淀步骤：
(1) | 力口 1/10 体积3M NaOAc,PH5.2,和2.5 倍体积乙醇. | cDNA 合成中需要的 RNA 的浓 |
(2) | 混匀，-20C 放置最少1 小时. | |
(3) | 4C ,＞ 12000x g 离心 20 分钟. | |
(4) | 80%乙醇洗涤沉淀 2 次. | |
(5) | 空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥 . | |
(6) | DEPC 处理水重新溶解沉淀.最合适的溶解体积由 |
度和量来决定.先阅读cDNA 合成的过程来决定这一步的适合溶解体积
4. RNA 测定
用分光光度计分析 RNA 浓度，在260nm 1 单位吸光度等于 40 卩g/mlRNA.
需要在260 和280nm 测定吸光度来确定样品的浓度和纯度
A260/A280 应接近2.0 为较纯的RNA(比值在1.9-2.1 也可)
＜二＞由纯化的总RNA 合成双链cDNA
AFFYMETRIX 强烈建议 HPLC 纯化 T7-(d7) 24 primer
一、第一链cDNA合成
开始RNA的量:高质量RNA5.0卩g-40.0卩g
纯化后RNA浓缩由260nm吸光度决定（1单位吸光度=40卩g/mlRNA）,A260/A280应接近
2.0，在1.8-2.1 的范围内。建议在检测前跑一个琼酯糖电泳测定该比较清晰没有明显的托影。
RNA质量。rRNA条带应
cDNA 合成前，DEPC 处理水和逆转录的正确体积必须确定。它由加到反应中的 RNA 浓
度和总体积决定。
表1.1 第一链cDNA 合成反应逆转录体积
总RNA (卩g) | SuperScript n RT( 3 l),200U/ 3 l |
5.0-8.0 | 1.0 |
8.1-16.0 | 2.0 |
16.1-24.0 | 3.0 |
24.1-32.0 | 4.0 |
32.1-40.0 | 5.0 |
RNA 和SuperScript n RT 体积不要超过 12 卩I 合成反应应在 1.5ML 离心管中进行（RNase-free） 表1.2 第一链cDNA 合成成分
|
| 体积 | 反应中最后浓度或 量 | ||
1:Primer | DEPC 水 | 到反应最后体积20 docs. | om | ||
| | | |||
RNA | 5.0-40 3 g | 5.0-40 3 g | |||
2:温度调节 | 5X First strand cDNA buffer | 4 3 l | 1 X | ||
0.1M DTT | 2 3 l | 10mM DTT | |||
10mM dNTP mix | 1 3 l | 500 3 M each | |||
3:第一链合成 | SuperScript n RT (200U/ 3 l) | 见表1.1 | 200U-1000U | ||
总体积 | 20 3 l | ||||
二、第二链cDNA 合成
1. | 第一链反应放置冰上。稍微离心甩下管壁试剂 | 1.3） |
2. | 在第一链合成的管中加入下列第二链反应试剂（见表 |
表1.3 第二链cDNA 合成成分
|
10mM dNTP mix | 3 卩l | 200 3 M each |
10U/ 卩 l E.coli DNA ligase | 1 卩l | 10U |
10U/l E.coli DNA polymerase I | 4 3 l | 40U |
2 U/ 卩 l E.coli Rnase H | 1 3 l | 2U |
终体积 | 150 3 l | |
3. | 混匀。稍微离心，16C 放置2 小时 4.力口 2 卩 I 【10U 】T4 DNA polymerase 16C 放置5 分钟 6.力口 10 卩 I 0.5M EDTA 7.继续纯化cDNA 步骤，或-20 C 储存 |
＜三＞纯化双链cDNA
一、PhaseLock Gels （PLG）酚/氯仿提取
1.＞12000g离心PLG管20-30秒，离下管壁PLG
2. 力口162卩l（等体积）的（25:24:1）酚：氯仿：异戊醇（10mMTris-HCL PH8.0,1 mM EDTA饱 和）到cDNA最后合成产物中（162卩l）,最后体积到324卩l。混匀，稍微离心。
3.转移上液至PLG管
4.不要混合，PLG会混入溶液中。》12000g离心2分钟
5.转移上层水相到一个新的 1.5ML离心管中。
二、乙醇沉淀
1.加0.5倍体积7.5MNH 4OAC和2.5倍体积乙醇（-20C储存）到样品中，混匀2.立即在室温下》12000g离心20分钟
4. 在室温下》12000g 离心5分钟 3. 去上清，0.5ML80%乙醇（-20C 储存）洗涤沉淀
6. 7.空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥12卩l Rnase-free 水重新溶解沉淀。5. 小心去掉80%乙醇，80%乙醇再洗涤一次
＜四＞生物素标记cRNA合成
参考BioArrayHigh Yield RNA Tran script Labeli ng kit
表1.4cDNA in IVT（总RNA）
总RNA （卩g） | IVT 中cDNA 体积 |
5.0-8.0 | 10 卩l |
8.1-16.0 | 5 卩l |
16.1-24.0 | 3.3 卩 l |
24.1-32.0 | 2.5 卩 l |
32.1-40.0 | 2 卩l |
表1.5cDNA体外转录成分
成分 | 体积 |
纯化后的cDNA （含总RNA） | 5 卩l |
水（Rnase-free） | 17 卩l |
10X HY Reage nt buffer | 4 3 l |
10X Biotin Labeled Ribo nucleotides | 4 3 l |
10X DTT | 4 3 l |
10X Rnase Inhibitor Mix | 4 3 l |
20 x T7 RNA Polymerase | 23 l |
终体积 | 40 3 l |
37C,4.5小时，600rpm振荡10秒/35分钟
＜五＞纯化和质控体外转录（IVT）产物
一、体外转录纯化
不要用酚-氯仿提取生物素标记RNA,生物素能导致部分RNA进入有机相，得到的量会减少。
保存部分没纯化的IVT产物凝焦电泳分析。
建议先纯化一半IVT产物，在纯化另一分前测定cRNA量。
如果样品在纯化过程中丢失，则可用保存的另一部分。如果IVT产物量很高，RNA的量
则会超出纯化能力。 那么纯化一半更好一点。
纯化后的cDNA的最小浓度是0.6卩g/卩I。建议的IVT纯化方法
（1）QIAGENRNeasy Columns（优先方法）
（2） CHROMASPIN-100（sizeexclusion spin columns）+EtOH沉淀
QIAGENRNeasy Columns 纯化
见试剂盒中参考手册
建议：
1?洗涤和洗脱之前将样品过柱两次。
2. 洗脱RNA 时加水到柱子后，静置一分钟，再离心。
CHROMASPIN-100S 和EtOH沉淀法纯化
1.加RNase-free水（60卩l）到IVT反应是体系至100卩l。
2.50 卩l （一半）样品装入柱子。
3.50卩lRNase-free水洗柱，在用流过柱子的样品洗柱。
二、乙醇沉淀（只适用于第二种纯化方法）
1.加0.5倍体积7.5MNH4OAc和2.5倍体积乙醇（-20C储存）到样品中，混匀。
2.-20 C沉淀1小时-过夜。
3.4C,A 12000g 离心30分钟。
4.0.5mL80%乙醇（-20C储存）洗涤沉淀2次。空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥。
5.10-20卩IRNase-free水重新溶解沉淀。
三、cRNA质控
用分光光度计分析RNA浓度.
需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度
A260/A280应接近2.0为较纯的RNA（比值在1.9-2.1也可）
下面的计算公式确定调整 cRNA的含量：
调整cRNA含量=RNAm-（totalRNA i）（y）
RNAm=IVT后测得cRNA量（卩g）totalRNAi=^始总RNA的量（卩g）y=在IVT过程中使用的Cdna的
倍数
四、凝胶电泳检测样品
同时跑纯化和没有纯化的 IVT产物有助于检测纯化过程丢失的范围。
0.1%琼酯糖凝胶电泳分析0.1%的样品
RNA和loadingdye混合，加热到65C,5分钟
＜六＞片断化cRNA
1.在新的1.5mLRNase-free离心管中按表1.6加入样品表1.6片断化反应
成分 | 体积 |
20 卩 g cRNA | 1-32 卩 l |
5X Fragmentation Buffer | 8 卩l |
RNase-free 水 | 到40 卩l |
2. | 94 C, 35 分钟。然后放置冰上。 | |
变性凝胶电泳，至少需要 | 1 卩g cRNA。 | |
-20 C 储存样品 | ||
第二章杂交
1.在新的1.5mL RNase-free 离心管中按表2.1 加入样品
表2.1杂交液
成分 | Micro/Mi ni Array | Midi | Stan dard Array | 终浓度 | |||
片断化cRNA | 5 卩g | 10 3 g | 15 3 g | 0.05 3 g/ 3 l | |||
Con trol Oligo nucleotide B2 (3nM) | 1.7 卩 l | 3.3 3 l | 5 3 l | 50pM | |||
Hybridizatio n Con trols (bioB,bioC,bioD,cre) | 5 卩l | 103 l | 15 3 l | 1.5,5,25,100pM respectively | |||
Herri ng Sperm DNA (10mg/ml) | 1 卩l | 23 l | 3 3 l | 0.1mg/ml | |||
Acetylated BSA (50mg/ml) | 1 卩l | 23 l | 3 3 l | 0.5mg/ml | |||
2 x Hybridization Buffer | 50 3 l | 1003 l | 150 3 l | 1 x | |||
水 | 至 100 3 l | 至 200 3 l | 至 300 3 l | | |||
终体积 | 1003 l | 200 3 l | 300 3 l | |
20xEukaryotic Hybridization Controls 冻存，使用前65C,5 分钟
2?使用前室温平衡探针
4.通过加样孔加入适量体积（见表2.2）1 x Hybridization Buffer 湿
3.99C,5 分钟
5.
6.
45C, 60rpm预杂交芯片10分钟
步骤3 处理过的样品45C,5 分钟润芯片
7.最大速离心5分钟
8.从芯片中取出Buffer,加等体积处理好的杂交液
9.45 C, 60rpm杂交芯片16小时
表2.2
Array | 杂交体积 | 总体积 |
Stan dard | 200 3 l | 250 3 l |
Midi | 130 3 l | 160 3 l |
Mini | 80 3 l | 100 3 l |
Micro | 80 3 l | 100 3 l |
第三章 | 洗脱、染色、扫描芯片 |
<一>实验和洗涤工作站设置
一、进入ExperimentInformation
洗脱、染色、扫描芯片之前都必须先定义一个 Experiment
二、准备洗涤工作站
基因芯片洗涤工作站400用来洗脱和染色探针阵列。
＜二＞洗脱和染色
1?杂交16 小时后，从芯片中取出杂交液装入一个新的离心管，2. Wash Buffer A 充满芯片
3?配制下列溶液
表3.1 SAPE 液（使用前配制，4C 储存）
放置冰上或-80C长时间保存。
成分 | 体积 | 终浓度 |
2X MES Stain Buffer | 600.0 卩 l | 1 X |
50mg/ml acetyed BSA | 48.0 3 l | 2mg/ml |
1mg/ml Streptavidin-Phycoerythrin(SAPE) | 12.0 卩 l | 10 3 g/ml |
DI 水 | 540.0 3 l | |
总体积 | 1200 3 l | |
表3.2 抗体溶液
| ||||||||||||||||||||||
4. 表3.3 | 洗涤工作站按表 | |||||||||||||||||||||
| 标准格式 | Midi 格式 | Micro/Mini 格式 | ||||||||
Post Hyb Wash#1 | 10 cycles of 2 |
mixes/cycle with Wash Buffer A at 30 C |
mixes/cycle with Wash Buffer A at 25 C | ||||||||
Post Hyb Wash#2 | 4 cycles of 15 |
mixes/cycle with Wash Buffer B at 50 C |
mixes/cycle with Wash Buffer B at 50 C | ||||||||
Stain | Stain the probe array for 10minu tes in | Stain the probe array for 5mi nu tes in SAPE solution at 35 C | Stain the probe array for 10mi nutes in SAPE solution at 25 C | ||||||||
Post | 10 cycles of 4 |
mixes/cycle with Wash Buffer A at 30 C |
mixes/cycle with Wash Buffer A at 30 C |
2nd | Stain the probe array for 10minu tes in | Stain the probe array for 5minu tes in an tibody solution at 35 C | Stain the probe array for 10minu tes in an tibody solution at 25 C | ||||||||
3nd | Stain the probe array for 10minu tes in SAPE solution at 25 °C | Stain the probe array for 5mi nu tes in SAPE solution at 35 C | Stain the probe array for 10mi nutes in SAPE solution at 25 C | ||||||||
Fi nal | 15 cycles of 4 |
mixes/cycle with Wash |
mixes/cycle with Wash Buffer A at 35 C |
＜三＞扫描
＜四＞关闭洗涤工作站
5X RNA Fragmentation Buffer: 附：溶液配制
4.0ml 1M Tris-acetate,PH 8.1(冰醋酸调节PH) 0.g MgOAc (200mM Tris-acetate,PH 8.1,500mM KOAc,150mMMgOAc)
0.98gKOAc
DEPC处理水至20ml
强烈搅拌，混合均匀
0.2m过滤
室温保存
12XMESStock :
(1.22MMES,0.M[Na +])
1000ml:
70.4gMES free acid mon ohydrate
193.3gMES Sodium Salt
800ml分子生物级水
混合，定溶至1000ml.PH在6.5-6.7之间
0.2i m过滤
不灭菌，2-8C避光保存2XHybridizationBuffer:
+
(1x :100mM MES, 1M [Na ],20mM EDTA,0.01%Tween2)
50ml:
8.3ml | 12 x MES Stock |
|
17.7ml 0.1ml | 5M NaCl 10%Twee n20 |
19.9ml水
2-8C避光保存
WashBuffer A :
(6xSSPE,0.01%Tween20)
1000ml:
300ml20 x SSPE
1.0ml10%Twee n20
698ml水
0.2m过滤
WashBuffer B :
(100mMMES,0.1M [Na +],0.01%Tween20)
1000ml:
83.3ml 910.5ml | 12x MES Stock Buffer | |
10%Twee n20水 |
| |
| ||
2xStainBuffer :
+
(1x :100mM MES, 1M [Na ],0.05%Tween20)
250ml:
41.7ml 12xMES Stock Buffer
92.5ml5M NaCl
2.5ml10%Twee n20
112.8ml水
0.2m过滤
2-8C避光保存10mg/mlGoat IgG Stock :
溶解50mg在5mlPBS中
4C保存